McNice

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7586198?ordinalpos=1&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DefaultReportPanel.Pubmed_RVDocSum


Carcinogenesis vol.16 no. 11 pp.2773-2777, 1995


三聚氰胺誘發F344雄鼠產生膀胱癌化現象：癌化與結石形成的關係


Hiroyuki Ogasawara, Katsumi Imaida¹, Hajimu Ishiwata², Kazuhiro Toyoda, Tom Kawanishi, Chikako Uneyama, Shuji Hayashi, Michihito Takahash³ and Yuzo Hayashi

Division of Pathology and ²Food Additives, National Institute of Health Sciences, Kamiyoga 1-18-1, Setagaya-ku, Tokyo 158, and ¹Department of Pathology, Nagoya City University Medical School, 1 Kawasumi, Mizuho-cho, Mizuho-ku, Nagoya 457, Japan

³通訊作者


摘要


使用三聚氰胺處理而產生的膀胱癌，以及伴隨而來的結石與器官機能障礙，彼此之間的相互關係，已經有使用氯化鈉來進行的相關研究出現，同時結石的化學組成也已經被著手分析。使用含有3或1％之三聚氰胺，合併使用三聚氰胺與10或5％之氯化鈉，以及10％氯化鈉的三種添加飲食來餵食F344/DuCrj雄性老鼠36週，之後再給予4週不含氯化鈉的飲食。水分的攝取會隨著氯化鈉處理而增加，同時也用作尿路排泄的指標數據。實驗發現，使用3%三聚氰胺處理的組別，膀胱的變形細胞癌 (transitional cell carcinoma)與乳頭狀瘤 (papilloma)，其發生率分別達到了90％與55%；而在合併使用3%三聚氰胺與10%氯化鈉的組別當中，兩種發生率則分別是有0％和15%，單獨以1%三聚氰胺處理的組別則是21％和42%，而其他組別的老鼠兩種癌症的發生率都是0％。服用三聚氰胺而形成的結石，可以使用氯化鈉處理來加以抑制，同時也會根據處理的劑量有著同步的抑制效果，但卻也會造成腎臟乳突的細胞增生。經由分析，結石的主要組成物質為三聚氰胺與尿酸 (佔總體積的61.1到81.2%)，兩者也具有相等的摩爾濃度。實驗結果指出，三聚氰胺所誘發的老鼠尿道損傷與異常增殖，是由結石所產生的直接刺激，而非來自於三聚氰胺本身分子間的交互反應，或是與膀胱的上皮細胞所產生的代謝物所造成。


背景介紹


以囓齒類動物研究結石與膀胱癌之關係，現已有許多研究發表。己烯雌酚 (Thethylstilbestrol)¹、二甘醇 (DEG, thethylene glycol)²、4-乙基磺醯萘磺胺 (ENS, 4-ethylsulfonylnaphthalene-1-sulfonamide)³、三乙酸基氨 (NTA, nitrilotriacetate)⁴、丹木斯 (Diamox,acetazolamide)⁵、對苯二甲酸 (TPA, terephthalic acid) 與對苯二甲酸二甲酯 (dimethyl terephthalate)⁶、尿嘧啶 (uracil)^7,8、胸腺嘧啶 (thymine)⁹，與秘克的 (bisacodyl)¹⁰等，都已經被歸類為可能會造成結石，晶體尿 (crystaluria)甚至誘發膀胱癌的化學物質。二甘醇和秘克的可以誘發雄性老鼠產生膀胱癌，而雌性老鼠則否^2,10。此外，根據使用4-乙基磺醯萘磺胺³與尿嘧啶⁷的實驗，抑制結石的形成，可以避免膀胱癌的發生，而先前也出現異體移植卻誘發膀胱受損與增生的現象^11-13。由此看來，物理或機械性的刺激很有可能就是主要成因。


三聚氰胺 (melamine, 2,4,6-triamino-^-triazine)是三聚氰胺-甲醛氨基樹脂 (melamine-f或maldehyde amino resin)的成分之一，主要使用在熱融膠的工業當中。Melmick等人主要是從事三聚氰胺在囓齒類動物體內的慢性毒素的研究¹⁴，也發現無論小鼠或大鼠，結石的發生率都是雄性高於雌性，然而膀胱的變形細胞癌 (TCCs, Transitional cell carcinomas )卻只出現在雄性老鼠身上，所以三聚氰胺在不同的物種之間似乎會著有不一樣的作用。先前Okumura等人已經發表過關於結石形成與腫瘤化之間顯著關係的研究⁹，同時自從三聚氰胺被認定不會造成基因變異之後^15-17，其會造成物理性或其他刺激的效果就更加的受人矚目。


囓齒類動物體內自發性或化學物質誘發的膀胱結石，其主要構成物目前已被報導過的有磷酸氨鎂 (magnesium ammonium phosphate)、檸檬酸鈣 (calcium citrate) 、草酸鈣 (calcium oxalate)，以及磷酸鈣 (calcium phosphate)等^18-20。某些蛋白質如尿黏蛋白 (uromucoid)則會促進草酸鈣與磷酸鈣結晶化，並且沉積在尿中，開始了最初的結石過程。而研究也顯示若是由尿嘧啶⁸和三聚氰胺^6,15所誘發的結石，將會是由這些刺激物質所組成。目前的研究是使用含有氯化鈉的飲食來探討三聚氰胺所引起的結石，同時也在評估結石與膀胱癌的關係。因此，由三聚氰胺所引起的膀胱結石現象，將有更進一步的認知。


材料與方法


實驗動物模式

從Charles River Japan, Inc. (Atsugi, Japan)取得五週大的F344/DuCrj雄性老鼠。將這些動物置於網狀不銹鋼鐵籠，並放置在附有隔離式空調系統的動物室當中，環境條件為溫度24±1°C，相對濕度55±5%，12小時光照與12小時黑暗的光週期，並使用粉末狀的基本營養食物 (MF, Oriental Yeast Co. Ltd, Tokyo, Japan)與不限量的自來水豢養。


化學藥品之使用

純度99.9％的三聚氰胺的來源為Mitui-Toatsu Chemical Co. Ltd (Osaka, Japan)。粉末狀的老鼠飲食 (MF)，混合5%或10%的氯化鈉 (Oriental Yeast Co. Ltd)，以三聚氰胺，或是含有5或10% 氯化鈉的1或3%三聚氰胺加入粉末狀老鼠飲食當中。


實驗設計

六週大的F344雄性老鼠分為八組， 第一組至第三組餵食3％，和第四組至第六組餵食1％的三聚氰胺，持續餵食36週，再在給予正常的基本飲食的恢復期4週。其中在餵食三聚氰胺時，第二組和第五組同時合併給予5％，第三組和第六組同時合併給予10％的氯化鈉，而第七組僅餵食含有10％氯化鈉的飲食36週，第八組則是正常飲食的對照組。在實驗期間，體重、食物消耗量、飲水等數據是每四周記錄一次；每組選取十隻老鼠，收集非外力壓迫而由動物自然產生的尿液檢體，使用吸管(dip-stick)與尿液溶解試劑來檢測尿液與其中的血球 (Maltistiks, Miles-Sankyo Co. Ltd, Tokyo, Japan)。第一和第八組取十隻老鼠，而第三與第七組取五隻老鼠，其尿液靜置24小時之後與代謝廢物盤一起收集。尿量與同滲重量莫耳濃度 (osmolality)分別在第12、24、36與40週時記錄。另外，同樣一批老鼠的尿液檢體使用離心以分層，並利用化學分析方法測定其中礦物質 (鈣、磷、鈉、氯、鉀)濃度。每組老鼠任選其中五隻，使用顯微鏡觀察其尿液沉積物。四十週之後仍生存的老鼠將使用乙醚麻醉後犧牲處理，在取出器官之前，膀胱與腎臟均使用10％中性緩衝福馬林 (formalin)灌流，使用福馬林固定之後供病理組織檢驗。在固定之前預先記錄腎臟的重量，同時膀胱的重量也在固定與染色之後紀錄，結石則是使用解剖顯微鏡進行觀測。


結石分析

40週後，在餵食含有1%三聚氰胺飲食的老鼠當中隨機選出四隻，並在其中取得四顆結石來進行化學分析。使用0.05 M磷酸緩衝液 (pH 3.0)來溶解結石，溶液中的三聚氰胺和尿酸將會使用高效能液相層析 (HPLC)來分析。分析用的高效能液相層析系統是由Shimadzu Shimpack CLC-ODS管柱 (6公釐X150公釐)，一台Shimadzu SPD-6A UVvis，波長235nm的偵測儀，Shimadzu LC-9A液相層析，以及Shimadzu Chromatopac C-R5A 整流器所組成(Shimadzu Inc. Ltd, Tokyo, Japan)。三聚氰胺與尿酸在40°C底下使用0.05M的磷酸緩衝液 (pH 3.0)以每分鐘0.8ml的流速析出，滯留時間分別為5.4分鐘與8.4分鐘。峰質是由HPLC和Shimadzu的SPD-M6A光二極體分析儀 (PD, photodiode-array detector)來鑑定。


統計分析

老鼠身體與器官的重量將會分析其變異係數或使用學生氏t檢定來計算，而結石與損傷的細胞增生，將使用Fisher's exact probability 檢定來計算其發生率。


實驗結果


在實驗過程當中，餵食含有1％三聚氰胺飲食的老鼠組別裡，有三隻老鼠意外死亡。餵食含有三聚氰胺和/或氯化鈉飲食共36週的老鼠，其增加的體重相較於普通飲食的老鼠為低，而其中餵食含有3％三聚氰胺飲食的老鼠，其最終的體重是所有組別中最輕的 (表一)，而其平均的食物消耗量，比起其他組別老鼠也是稍微的少。能代表尿量的飲水攝取，會隨著氯化鈉的濃度而呈現同步的改變。餵食含有3％三聚氰胺飲食的老鼠，從餵食的第四週開始，其飲水量明顯的多過普通飲食的對照組老鼠。


餵食含有3％三聚氰胺飲食的老鼠同時能觀察到尿中含有血，但若給予10％氯化鈉則可抑制此現象 (結果未表示)。在36週時給予所有老鼠飢餓處理，餵食含有3％三聚氰胺飲食的老鼠可得到最高的尿量，與同滲重量莫耳濃度呈現逆關係 (inverse relation) (表二標示了各種礦物質的濃度)。餵食含有3％三聚氰胺飲食的老鼠，在尿液沉積物上都可以觀察到許多形狀不規則的微小結晶，而無論有無合併氯化鈉處理；同時，在餵食含有3％三聚氰胺飲食的老鼠體內，還可以觀察到上皮細胞的脫落現象 (表二)。


餵食含有3％三聚氰胺飲食的老鼠組別的膀胱重量，比起餵食合併3％三聚氰胺與10％氯化鈉飲食，甚至是普通飲食的老鼠都來得重。(表三).


圖表四是實驗動物的膀胱在病理組織上的發現與結石形成的資料整理。在使用含有三聚氰胺的食物餵食36週的老鼠組別當中，於第40週時都能觀察到出現了膀胱的變形細胞瘤和乳頭狀瘤的現象。在餵食含有3％三聚氰胺飲食，與含有3%三聚氰胺合併5%氯化鈉的老鼠組別身上，都有很高的膀胱變形細胞瘤發生率 (90%)，但在餵食同時含有3％三聚氰胺與10％氯化鈉的老鼠身上卻沒有這種現象。在餵食含有1％三聚氰胺飲食的老鼠組別當中，變形細胞瘤的發生率甚至降低到5 或10%氯化鈉處理。在餵食含有3％三聚氰胺合併10％氯化鈉飲食的老鼠組別上，比起餵食含有3％三聚氰胺飲食的老鼠組別，其變形細胞瘤與乳頭狀瘤的發生率也有相當顯著的下降。若將餵食含有1％三聚氰胺飲食的老鼠同步餵食5或10%的氯化鈉，這些細胞異常的現象將可以完全被抑制。


膀胱結石大部分為白色，形狀大小都沒有固定，這些資料都整理在表四當中。餵食同時含有3％三聚氰胺與5％氯化鈉的老鼠的組別，有著在全部組別當中最高的結石比率，高達75％。在餵食含有3％三聚氰胺飲食的老鼠組別身上，並沒有觀察到任何結石形成與氯化鈉處理之間的明確關係，而餵食含有1%三聚氰胺飲食的老鼠，補充氯化鈉確實可以稍微降低症狀。


在40週之後，器官的重量與腎臟在病理組織學上的特徵都在表五中呈現。在腎臟的重量比較上， 餵食含有3％三聚氰胺飲食的老鼠與餵食含有1％三聚氰胺飲食的老鼠，其腎臟重量都比對照組的老鼠的腎臟來得低，但若服用氯化鈉，則會改變此現象。所有老鼠的腎臟乳突變形細胞都有不正常增生的現象，同時有一部分也出現血管擴張與血拴的情形。在所有老鼠身上也都可以觀察到缺血而造成的局部損傷與纖維化，合併發炎反應所引起的細胞滲透現象與腎小管再生等等異常情形，而餵食含有3％三聚氰胺飲食的老鼠用氯化鈉處理，則可以減緩這些現象，減緩的程度隨著氯化鈉的濃度不同而作同步改變；若同時將餵食含有1％三聚氰胺飲食的老鼠使用氯化鈉處理，更可以完全抑制。


結石分析


如同在圖片1(B)所表示，結石可以得到兩個分離的峰質，同時其滯留時間為5.4與8.4分鐘，都與三聚氰胺和尿酸的標準物相一致。使用光二極體分析儀得到每個峰質的紫外線光譜也有相同的結果。使用HPLC層析儀在波長235nm之下使用紫外線偵測每個峰質，也可以得知結石成分中的三聚氰胺和尿酸。


如表六所示，從餵食含有1％三聚氰胺飲食的老鼠組別當中任意挑選出的四隻老鼠，取得其結石中的三聚氰胺與尿酸後測定濃度，可以得到其尿酸的摩爾濃度為61.1到81.2%，而三聚氰胺的摩爾濃度為0.99-1.05。這樣的結果代表著，使用含有三聚氰胺的食物餵食的雄性老鼠，其尿道結石的主要結構物，是三聚氰胺與尿酸所形成的塩類。


討論


在本篇研究當中，使用含有三聚氰胺的食物餵食36週的老鼠，在40週結束的時候都出現了結石與膀胱的變形細胞瘤與乳頭狀瘤。餵食5％或10%的氯化鈉，可以抑制器官的損傷與不正常增生，同時飲水量也隨著氯化鈉的濃度而跟著提升。除了餵食含有3%三聚氰胺飲食的老鼠組別以外，結石的形成，可以用同步氯化鈉處理來抑制。Fukushima等人指出，氯化鈉對結石的作用可能是來自於氯化鈉所造成的頻尿現象 (polyuria)，因此可以促進排出尿嘧啶所引起的小型結石，同時也避免結石的形成與體積增加⁷。這種機制也可以應用在三聚氰胺的研究上，頻尿除了能夠避免結石產生，同時也因為減少刺激和傷害，所以減少了三聚氰胺所引起的細胞損傷與異常增生。因此，結石與膀胱癌之間的緊密關係就可以被間接證實，同時也能符合先前的許多相關研究^6,9,14,15。


許多研究者都發現，餵食尿嘧啶飲食的老鼠，其腎臟損傷經常伴隨著膀胱瘤和結石，包括腎盂(renal pelvis)中的腫瘤和乳頭狀瘤⁷，然而服用三聚氰胺的老鼠體內雖然有明顯的發炎反應與腎臟疾病，但卻同樣的沒有發現任何贅瘤^14,15。不過在本實驗當中，腎臟的變形細胞的增生與缺血現象，在餵食36週的3％三聚氰胺飲食之後更加顯著，同時既然這種現象可以被氯化鈉以不同的劑量加以同步抑制，我們也能推論出，尿液沈澱物中觀觀察的微小結石，可能在腎盂時就已經形成，同時也已經開始刺激腎臟的表皮細胞。


三聚氰胺不會被F344老鼠代謝²¹，口服之後很快的就能被吸收，在六十分鐘左右血液中的三聚氰胺濃度就會達到最大值，而大約在服用的24小時之後就會幾乎全部隨著尿液排出。Heck等人給予剛斷奶的F344雄性老鼠1％或更高的三聚氰胺，結果發現結石的產生與餵食的三聚氰胺有絕對的線性相關⁶。尿結石的成因並不一定，例如飲食，化學物質，膀胱移植，感染，代謝失調甚至環境的影響，都有可能造成結石的產生²⁰，而飲食中化學物質所造成的結石，卻有一定門檻的限制⁶。


在大部分的例子當中，草酸鈣與磷酸鈣都是尿道結石的主要成份， 而在使用二甘醇餵食雄性老鼠之後，草酸鈣經常會伴隨著腫瘤在膀胱出現²。對苯二甲酸鈣(calcium terephthalate)所構成的結石，經常可以在對苯二甲酸處理之後的動物身上發現6。至於三聚氰胺所造成的結石，主要成份已經被報導就是三聚氰胺本身^6,15，如同尿嘧啶一樣⁸。而本篇研究卻是第一個發現三聚氰胺造成的結石，成份其實主要是三聚氰胺與尿素由相同比例所形成的塩類。在鳥類動物當中，尿酸是含氮廢物代謝的最終產物，最後經由尿的形式排出體外，同時囓齒類動物也是如此 (雖然並不是尿中最主要的產物)。然而在本次實驗當中，這樣微量的尿酸已經足以在F344雄性老鼠體內形成三聚氰胺-尿酸塩類了。


本篇研究的結論是，在F344雄性老鼠體內，由三聚氰胺所誘發的尿道損傷與細胞增生，是起因於結石帶來的刺激和傷害，而非三聚氰胺本身分子間的交互作用，或是三聚氰胺與膀胱上皮細胞的代謝產物所造成的。


誌謝

作者群感謝Ms K.Furuta與R.Yazawa在動物實驗照顧與組織學檢體製備上所提供的幫助。


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Received on May 24, 1995; revised on July 31, 1995; accepted on August 7. 1995